截短侧耳素 (截断侧耳素大孔树脂吸附提取分离)

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截短侧耳素 (截断侧耳素大孔树脂吸附提取分离)2021年11月2日发(作者:焦末成型机)

2012年5月第2卷第9期 ・综 述・ 截短侧耳素制备方法的研究概况 金学平 吴旭乾 阮建兵 周佳麟 梅春秋 牛克勤 武汉软件工程职业学院环境与生化工程系,湖北武汉430205 【摘要】截短侧耳素作为中间体用于半合成抗生素的制备,其市场需求不断扩大,截短侧耳素的制备方法备受关注,通过 文献资料检索和市场调研,从生物合成途径、生物发酵方法、分离纯化技术3个方面归纳总结截短侧耳素的制备方法研 究进展。 【关键词】截短侧耳素;发酵;分离;纯化 【中图分类号】R914.4 【文献标识码】A 【文章编号】2095—0616(2012)09-69—02 2007年葛兰素史克(GSK)公司在美国和欧盟成功上市截 存在的差异使得该萜类化合物的化学结构有所不同;三环结构 短侧耳素类人用抗生素瑞他莫林(retapamulin,1),使得截短侧 的中间体经细胞素P450氧化酶引人c3羰基、C11羟基,然 耳素(pleuromutilin,2)的市场需求不断增加(图1-2 o目前市 后再经酰基转移酶接上C14的酰化基团,最终得到截短侧耳素 场上销售截短侧耳素的规格有85%、92%、95%三种纯度。销 (图3)。 售市场占8%的截短侧耳素直接作为添加剂使用,89%用于衍 生物的制造,3%用作其他。中国市场调查研究中心数据显示, 国内截短侧耳素的销售收入2006年37 932万元;2007年 42 678万元;2008年46 701万元;2009年达到53 367万元, 同比增长14.27%。随着截短侧耳素衍生物开发研究的不断深 萜环化酶 …‘ .. 入,带来了截短侧耳素强劲的市场需求,使得截短侧耳素的制 Ho/丫 oll O f 备方法研究备受关注。 图3 截短侧耳素的生物合成过程 H 2截短侧耳素的发酵过程 , 截短侧耳素主要采用静置发酵或者深层液体发酵方法 制备。截短侧耳素产生菌有侧耳属(Pleurotus sp.)和斜盖 菇属(Clitopilus sp.)中的部分菌种,常用菌株为P.mutilus和 P.passeckerianus。静置发酵时采用的玉米浆培养基,培养4周 后,收取表层菌丝体,用葡萄球菌进行活性测定,发现P.mutilus 菌液达到51 一2稀释单位/mL,P.pa. ̄eckerianus为256稀释单位/mL。 m 。 深层液体发酵时,P.mutilus培养10 d,活性就可达到256稀释 H0 单位,而P. 一一 一 passeckerianus活性较低,只有8稀释单位。深层液 O /J 1 体发酵时,葡萄糖的消耗约在72 h达到低点,氮源的消耗情况 C H 3J 和碳源消耗类似。产物的产量从发酵开始逐天增加,在144 h 图2 pleuromutilin.2 开始逐渐达到稳定,产物最大量约为2.2 mg/mL。 1 截短侧耳素的生物合成 为了提高截短侧耳素的产量,主要嗣绕菌种改良、发酵优 截短侧耳素属双萜类化合物,而萜类化合物的生物合成通 化、诱导因子和分离纯化几方面展开研究工作。从分子水平 常是从乙酰辅酶A开始途经羟甲基戊二酰辅酶A(HMG—CoA) 上对菌体进行改良的研究时有报道,但未取得实质性进展,截 和二羟甲基戊酸(MVA)进入异戊二烯(IPP)前体合成;IPP 短侧耳素二萜环化酶基因克隆及功能研究是重要的技术瓶颈。 与DMAPP(dimethylallyl pyrophosphate)形成单萜的前体物质 李冰…报道称国外有科学家对截短侧耳素产生菌Clitopilus GPP(geranyl diphosphate),再经缩合和异构形成倍半萜和二萜 passeckerianus的遗传表达系统进行了初步的研究。诱变育 前体物质FPP(farnesyl diphosphate)和GGPP(geranylgerany| 种是常用的菌种选育方法,Papa等[21用0.15 mg/mL亚硝基胍 diphosphate o GGPP是截短侧耳素生物合成的前体,GGPP在 (NTG)对截短侧耳素产菌Clitopilus passeckerianus进行诱变 二萜环化酶的作用下形成三环结构的中间产物,这一步是该途 所得最高产量与亲代相比提高了89.36%。陈晓丽等【3J对截短 径的限速步骤,二萜环化酶是一种限速酶,不同二萜环化酶所 侧耳素产生菌Clitopilus prunulus一04用NTG进行诱变,筛选 得到的突变子pn163的截短侧耳素产量最高,比出发菌株提高 【基金项目】湖北省教育厅科研项目(B20117302 o 了38.5%,且遗传稳定性好。黄宇琪等I41在实验室分离并初步 CHINA MEDICINE AND PHARMACY十一I药蚪誓69 

・综 述・ 鉴定P4—04为产截短侧耳素的斜盖菇属的新种,在以果糖为碳 源、以黄豆粉饼为氮源、添加硫酸铁等条件下产量比原始条件 下提高73.1%。 微生物发酵优化常用的策略是传质优化和补料优化。产 生菌担子菌形状为菌丝状,高速搅拌和高通气量可能会对菌丝 损伤较大,而过小则可能导致供养不足,影响发酵过程,应该从 搅拌浆的类型和转速、通氧量等优化传质条件。补料优化策略 有:直接反馈控制补料速率法是基于pH或者溶解氧(DO)的 变化超过预定值以后,系统自动或者人lT调节补料速率,改善 发酵过程;预定速率补料法是假设菌体在一定的时间范围内指 数增加,从而补给指数增加培养基,以满足生长的需要;底物反 馈补料法如通过在线或者离线的方法定期检测发酵罐内残糖 浓度,当其不足的时候给予补充,使其浓度在一定的范围内;带 放料的补料方法,陈剑慧等[51采用在210—230、240—260、 270~290 h等不同发酵时间阶段实施放料10%,补料玉米浆 和豆饼粉,流加葡萄糖的方法控制发酵过程,可使效价达到10 000—11 000 /mL;发酵指数为0.036十亿/(m h),发酵 罐利用率可达到95%一105%。 促进生物合成的诱导因子主要有添加前体、光照等。适量 的抗真菌药在适当时间添加可有效促进抗生素的生物合成,陈 晓丽等 用制霉菌素、特比萘酚、十二烷基苯磺酸钠和十二烷 基三甲基氯化铵进行抗性突变子筛选获得了大量产量提高的 突变子。制霉菌素和特比萘酚抗性突变子的正突变率较高,如 12 g/mL的盐酸特比萘酚在48 h可以有效调控截短侧耳素生 物合成,经7 L发酵罐放大验证表明较为稳定。 3截短侧耳素的分离纯化 截短侧耳素的分离纯化方法主要有溶剂提取法、超临界 法、膜过滤法。目前截短侧耳素分离纯化多采用溶剂提取法, 胡昌华等【6J从截短侧耳素的全发酵液中分离出菌丝体,经干 燥、粉碎、过筛,烘焙至含水量低于5%,烘焙菌丝体用醋酸丁 酯浸提,过滤水洗滤液,干燥脱,回收溶剂,静置析晶得截短 侧耳素;胡江林等[71将截短侧耳素的干菌丝用甲基异丁基甲 酮浸取得粗品,再用甲醇溶解后先后用石油醚和乙酸丁酯萃 取,经浓缩、结晶,乙醚洗涤、脱得成品;Rees MJIs1报道了甲 基异丁基甲酮一步法对截短侧耳素的提取纯化方法,但该法 溶剂使用量大,生产成本高;张翔等191分别用冰醋酸、丙酮、 正己烷、无水乙醇、甲醇、水、甲基异丁基甲酮、醋酸丁酯、醋酸 乙酯、二氯甲烷和i氯甲烷作为萃取溶剂,对截短侧耳素的全 发酵液的干菌丝进行浸提对照试验,同时采用单因素实验法 从提取时间、液料比、转速、提取次数等几方面考察其对提取 率的影响,在此基础上重点对醋酸丁酯浸提法进行正交实验 优化提取条件,使截短侧耳素醋酸丁酯浸提法的提取率达到 94.56%。 谢昌贤等[1o1将烘焙菌丝体置于超临界萃取罐中,在压力 l2~24 MPa,温度35~55℃,二氧化碳流速为25 kg/h条件下, 70十一E药垂干荸CHINA MEDICINE AND PHARMACY 201 2if-5月第2卷第9期 萃取60~100 min,然后收集萃取物,经处理后得截短侧耳素。 该工艺提取时间短,产物杂质少,溶剂使用量小。 王素霞等…】将截短侧耳素菌丝体与甲醇或乙醇混合,在 20~40%下持续搅拌3~6 h,将浸提液在一定压力下通过密 封式无机膜过滤,滤液送人后续加工,部分残液返回浸提罐,另 一部分经循环泵通过无机膜循环过滤,该工艺过程比传统板框 过滤工艺每天缩短6 10 h,收率提高5%~7%,减少了溶剂 的挥发,改善了生产环境。 日本住友制药公司开发的水溶性好,代谢稳定的截短侧耳 素类新衍生物,N abriva和GSK制药公司的口服妙林类抗生素 相继进入临床,国内上海药物所杨玉社等、南通大学王新杨等 在新型截短侧耳素衍生物的开发取得了阶段性成果,预示着这 类化合物良好的开发前景,直接刺激截短侧耳素原料药的产量 需求。目前国内外对截短侧耳素原料药的制备方法报道较少, 国内传统的生产工艺存在能耗大、成本高、污染环境等问题,优 化截短侧耳素的生产工艺,提高产品质量,降低生产成本是攻 关的重点,在产生菌的选育、发酵过程控制和分离纯化方法等 环节需要进行深入研究,尤其是在分子水平上菌种选育_T作更 需加强,以提高截短侧耳素原料药的质量和产量,满足当前和 未来市场之需求。 【参考文献】 【1]李冰.截短侧耳素生物合成的代谢调控与发酵优化【D】.重庆:西南大学, 2011:6. 【2】Papa IA.Increasing pleuromutilin activity of clitopilus passeckerianus by chemical mutagenesisand improvement of production medium[J].Philos Agr Sci, 2006(89):20—33. [3】陈晓丽,张文琦,胡昌华.高产截短侧耳素担子菌的抗性突变株筛选【JJ. 中国生物工程杂志,2010,30(8):67—71. 【4】黄宇琪,张怡,胡昌华.截短侧耳素产生菌的鉴定及发酵培养基的初筛『J1. 四川大学学报(自然科学版),2008,45(3):699—702. 【5】陈剑慧,韩勤更,冒永松,等.截短侧耳素的发酵方法【P1.CN101319234A, 2008—12—10. f6胡昌华,张翔,邹祥.截短侧耳素的溶剂提取l6】T艺【PJ.CN101838199A, 20l0-09-22. 【7]胡江林,王斌,王永恒,等.一种截短侧耳素的提取纯化方法IP1. CN102050737A.2011—05一l1. [81 Rees M J.Method for reproducing pleuromutilins[P].US20060166341A1,2006- 07-27. 【9]张翔,黄宇琪,邹祥,等.截短侧耳素溶剂提取T艺的优化【J1.食品与发酵 T业,2010,36(5):151—155. 【10]谢昌贤,邓维康,刘运添,等.截短侧耳素的超l临界二氧化碳萃取工艺【P】 lCN1Ol885681A.2010—11—17. [11]王素霞,金作宏,高文果,等.一种截短侧耳素提取工艺 .CN101481308A, 2009—07一l5. (收稿13期:2012—03—12) 

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发布时间:2021-11-23 23:13:59
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  1.  与DMAPP(dimethylallyl pyrophosphate)形成单萜的前体物质 李冰…报道称国外有科学家对截短侧耳素产生菌Clitopilus GPP(geranyl diphosphate)

  2. 等.截短侧耳素的发酵方法【P1.CN101319234A

  3. 预示着这 类化合物良好的开发前景

  4. 带来了截短侧耳素强劲的市场需求

  5. 最终得到截短侧耳素 场上销售截短侧耳素的规格有85%

  6. 高速搅拌和高通气量可能会对菌丝 损伤较大

  7. 流加葡萄糖的方法控制发酵过程